中国禽病网：中华人民共和国农业农村部公告 第153号 2024-02-19 22:25:17 0 0 根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，我部组织制定了禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清等3种兽药产品制造及检验试行规程、质量标准、说明书和内包装标签，现予发布，自发布之日起执行。 特此公告。 附件：1. 兽药产品目录 2. 试行规程 3. 质量标准 4. 说明书和内包装标签 农业农村部 2019年3月29日 附件1 兽药产品目录 兽药名称 研制单位 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 附件2（略） 附件3（略） 附件4 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清等3种兽药产品说明书和内包装标签 一、禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书和内包装标签 （一）禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书 兽用 【兽药名称】 通用名 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 商品名 无 英文名 Avian Influenza VirusH5 Subtype（Strain Re-11）Hemagglutination Inhibition Test Antigen,Positive Sera and Negative Sera 汉语拼音 Qinliuganbingdu H5 Yaxing （Re-11 zhu）Xueningyizhishiyan Kangyuan，Yangxingxueqing Yu Yinxingxueqing 【主要成分与含量】 抗原为灭活的H5亚型（Re-11株，2.3.4.4d分支）禽流感病毒，血凝（HA）效价不低于1:128。测定鸡血清时，使用鸡禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清，血凝抑制（HI）抗体效价不低于1:128；使用鸡禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:4。测定鸭血清时，使用鸭禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清， HI抗体效价不低于1:160；使用鸭禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。测定鹅血清时，使用鹅禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清， HI抗体效价不低于1:160；使用鹅禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。 【性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）抗体。 【用法与判定】 1 材料 1.1 96孔V型（90度）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。 1.2 pH值7.0～7.2，0.01mol/L的PBS 按照如下方法配制或购买商品化产品，PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。PBS 配制方法：秤量NaCl 80g、KCl 2g 、十二水磷酸氢二钠 36.3g、磷酸二氢钾 2.4g，溶解于ddH2O中，并定容至10L，用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0～7.2，最后121℃灭菌30分钟或过滤后使用。 1.3 阿氏（Alsevers）液 称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。 1.4 1%鸡红细胞悬液 采取2～4只 2～6月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS（0.01mol/L，pH值7.0～7.2，下同）洗涤3～4次，每次以1500r/min离心5～10分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。 1.5 抗原溶解 冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。 2 操作术式 2.1 血凝（HA）试验 2.1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。 2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。 2.1.3 从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。 2.1.4 每孔加0.025ml PBS。 2.1.5 每孔加入0.025ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液。 2.1.6 结果判定 将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温20～30分钟或置2～8℃ 45～60分钟，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。 2.2 血凝抑制（HI）试验（鸭、鹅血清在检测血清时需要进行前处理，参考方法见注意事项） 2.2.1 根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1:1024（举例），4个血凝单位（即4 HAU）=1024/4=256（即1:256）。取PBS 9.0ml，加抗原 1.0ml，即成1:10稀释，将1:10稀释液 1.0ml加入到 24.6 ml PBS中，使最终浓度为1:256。 2.2.2 四个单位血凝单位检测 检查4 HAU的血凝价是否准确，应将配制的1∶256稀释液进行系列稀释，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温20～40分钟或置2～8℃ 40～60分钟，如果配制的抗原液为4 HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如果4 HAU高于4个单位，可能1:5或1:6为终点；如果较低，可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4 HAU。 2.2.3 第2～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。 2.2.4 第1、2孔加入0.025ml血清；第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔，依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。 2.2.5 第1～11孔均加入0.025ml的4HAU抗原，在室温（20～25℃）下静置至少20分钟或2～8℃ 至少60分钟。 2.2.6 每孔加入0.025ml 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20～40分钟或2～8℃ 40～60分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 3 结果判定 以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。检测鸡血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1:4时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:8判为阴性，不低于1:16判为阳性。检测鸭和鹅血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于1:10时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:10判为阴性，高于1:10（不含1:10）判为阳性。 【注意事项】 （1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。 （2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。 （3）用pH值7.0～7.2的PBS（0.01mol/L）作为稀释液。 （4）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。 （5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。 （6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超过1个月。 （7）同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI抗体效价不同。 （8）鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。 ① 胰酶-加热-高碘酸盐法 A.取0.3ml血清，加0.15ml胰酶溶液（8 mg/ml：200mg的P-250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，分装并在−15℃以下保存，保存期6个月），混匀后，在56℃水浴灭活30分钟后冷却至室温。 B.再加入0.9ml高碘酸钾（将230mg的KIO4用0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS，定容至100ml，过滤除菌后避光室温保存，保存期1周），混合，室温孵育15分钟。 C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液（1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15分钟。 D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4℃保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 ② 受体破坏酶（RDE）处理法 A.1体积血清（50μl），加4体积RDE（200μl），37℃水浴18小时（过夜）。 B.再加入5体积（250μl）的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56℃水浴30分钟（以破坏残余的RDE活性）。 C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中（50μl红细胞+500μl血清），震荡混匀后4℃放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。 D.1000g离心10min，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 【规格】 （1）1ml/瓶 （2）2ml/瓶 【包装】 （1）10瓶/盒 （2）24盒/箱 （3）60盒/箱 【贮藏与有效期】 −15℃以下保存，有效期为24个月。 【批准文号】 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 （二）禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原、阳性血清和阴性血清内包装标签 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）血凝抑制试验抗原 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）抗体。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【 生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-11株）阳性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.4.4d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 二、禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书和内包装标签 （一）禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书 兽用 【兽药名称】 通用名 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 商品名 无 英文名 Avian Influenza Virus H5 Subtype（Strain Re-12）Hemagglutination Inhibition Test Antigen, Positive Sera and Negative Sera 汉语拼音 Qinliuganbingdu H5 Yaxing （Re-12 zhu）Xueningyizhishiyan Kangyuan,Yangxingxueqing Yu Yinxingxueqing 【主要成分与含量】 抗原为灭活的H5亚型（Re-12株，2.3.2.1d分支）禽流感病毒，血凝（HA）效价不低于1:128。测定鸡血清时，使用鸡禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清，血凝抑制（HI）效价不低于1:128；使用鸡禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:4。测定鸭血清时，使用鸭禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清，HI抗体效价不低于1:160；使用鸭禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。测定鹅血清时，使用鹅禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清，HI抗体效价不低于1:160；使用鹅禽流感病毒H5亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。 【性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（2.3.2.1d分支）抗体。 【用法与判定】 1 材料 1.1 96孔V型（90度）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。 1.2 pH值7.0～7.2 0.01mol/L PBS 按照如下方法配制或购买商品化产品，PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。PBS 配制方法：秤量NaCl 80g、KCl 2g、十二水磷酸氢二钠 36.3g、磷酸二氢钾 2.4g，溶解于ddH2O中，并定容至10L，用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0～7.2，最后121℃灭菌30分钟或过滤后使用。 1.3 阿氏（Alsevers）液 称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。 1.4 1%鸡红细胞悬液 采取2～4只 2～6月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS（0.01mol/L，pH 值7.0～7.2，下同）洗涤3～4次，每次以1500r/min离心5～10分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。 1.5 抗原溶解 冻干的抗原和血清均按瓶签规格标注的量，用PBS溶解。 2 操作术式 2.1 血凝（HA）试验 2.1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。 2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。 2.1.3 从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。 2.1.4 每孔加0.025ml PBS。 2.1.5 每孔加入0.025ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液。 2.1.6 结果判定 将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温20～30分钟或置2～8℃ 45～60分钟，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。 2.2 血凝抑制（HI）试验（鸭、鹅血清的在检测时需要进行前处理，参考方法见注意事项） 2.2.1 根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1:1024（举例），4个血凝单位（即4 HAU）=1024/4=256（即1:256）。取PBS 9.0ml，加抗原 1.0ml，即成1:10稀释，将1:10稀释液 1.0ml加入到 24.6 ml PBS中，使最终浓度为1:256。 2.2.2 四个单位血凝单位检测 检查4 HAU的血凝价是否准确，应将配制的1:256稀释液分别进行系列稀释，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温20～40分钟或置2～8℃ 40～60分钟，如果配制的抗原液为4 HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如果4 HAU高于4个单位，可能1:5或1:6为终点；如果较低，可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4 HAU。 2.2.3 第2～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。 2.2.4 第1～2孔加入0.025ml血清，第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔，依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。 2.2.5 第1～11孔均加入0.025ml的4HAU抗原，在室温（20～25℃）下静置至少20分钟或2～8℃ 至少60分钟。 2.2.6 每孔加入0.025ml 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20～40分钟或2～8℃ 40～60分钟，对照孔红细胞呈呈显著纽扣状时判定结果。 3 结果判定 以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。检测鸡血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1:4时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:8判为阴性，不低于1:16判为阳性。检测鸭和鹅血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1:10时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:10判为阴性；高于1:10（不含1:10）判为阳性。 【注意事项】 （1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。 （2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。 （3）用pH值7.0～7.2的PBS（0.01mol/L）作为稀释液。 （4）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。 （5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。 （6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超过1个月。 （7） 同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI抗体效价不同。 （8）鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。 ① 胰酶-加热-高碘酸盐法 A.取0.3ml血清，加0.15ml胰酶溶液（8 mg/ml：200mg的P-250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，分装并在−15℃以下保存，保存期6个月），混匀后，在56℃水浴灭活30分钟后冷却至室温。 B.再加入0.9ml高碘酸钾（将230mg的KIO4用0.01mol/L, pH值 7.0∼7.2的PBS，定容至100ml，过滤除菌后避光室温保存，保存期1周），混合，室温孵育15分钟。 C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液（1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值 7.0∼7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15分钟。 D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4℃保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 ② 受体破坏酶（RDE）处理法 A.1体积血清（50μl），加4体积RDE（200μl），37℃水浴18小时（过夜）。 B.再加入5体积（250μl）的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56℃水浴30分钟（以破坏残余的RDE活性）。 C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中（50μl红细胞+500μl血清），震荡混匀后4℃放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。 D.1000g离心10分钟，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 【规格】 （1）1ml/瓶 （2）2ml/瓶 【包装】 （1）10瓶/盒 （2）24盒/箱 （3）60盒/箱。 【贮藏与有效期】 −15℃以下保存，有效期为24个月。 【批准文号】 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 （二）禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清内包装标签 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）血凝抑制试验抗原 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型（2.3.2.1d分支）抗体。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.2.1d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.2.1d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型（Re-12株）阳性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【用途】 用于禽流感病毒H5亚型（2.3.2.1d分支）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H5亚型阴性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H5亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 三、禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书和内包装标签 （一）禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清说明书 兽用 【兽药名称】 通用名 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清 商品名 无 英文名 Avian Influenza Virus H7 Subtype（Strain H7-Re2）Hemagglutination Inhibition Test Antigen, Positive Sera and Negative Sera 汉语拼音 Qinliuganbingdu H7 Yaxing （H7-Re2 zhu）Xueningyizhishiyan Kangyuan,Yangxingxueqing Yu Yinxingxueqing 【主要成分与含量】 抗原为灭活的H7亚型禽流感病毒（H7-Re2株），血凝（HA）效价不低于1:128。测定鸡血清时，使用鸡禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清，血凝抑制（HI）抗体效价不低于1:128；使用鸡禽流感病毒H7亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:4。测定鸭血清时，使用鸭禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清， HI抗体效价不低于1:160；使用鸭禽流感病毒H7亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。测定鹅血清时，使用鹅禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清， HI抗体效价不低于1:160；使用鹅禽流感病毒H7亚型阴性血清，HI抗体效价不高于1:10。 【性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）抗体。 【用法与判定】 1 材料 1.1 96孔V型（90度）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。 1.2 pH值7.0～7.2 0.01mol/L PBS 按照如下方法配制或购买商品化产品，PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。PBS 配制方法：秤量NaCl 80g、KCl 2g 、十二水磷酸氢二钠 36.3g、磷酸二氢钾 2.4g，溶解于ddH2O中，并定容至10L，用氢氧化钠或盐酸调pH值至7.0～7.2，最后121℃灭菌30分钟或过滤后使用。 1.3 阿氏（Alsevers）液 称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。 1.4 1%鸡红细胞悬液 采取2～4只 2～6月龄SPF鸡的血液，与等量阿氏液混合，然后用PBS（0.01mol/L，pH值7.0～7.2，下同）洗涤3～4次，每次以1500r/min离心5～10分钟，将沉积的红细胞用PBS配制成1%悬液。 1.5 抗原溶解 冻干的抗原和血清均按瓶签规格标注的量，用PBS溶解。 2 操作术式 2.1 血凝（HA）试验 2.1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。 2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。 2.1.3 从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行2倍系列稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃去。 2.1.4 每孔加0.025ml PBS。 2.1.5 每孔加入0.025ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液。 2.1.6 结果判定 将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，置室温20～30分钟或置2～8℃ 45～60分钟，当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。 2.2 血凝抑制（HI）试验（鸭、鹅血清在检测时需要进行前处理，参考方法见注意事项） 2.2.1 根据HA试验测定的效价，如果抗原凝集价测定结果为1:1024（举例），4个血凝单位（即4 HAU）=1024/4=256（即1:256）。取PBS 9.0ml，加抗原 1.0ml，即成1:10稀释，将1:10稀释液 1.0ml加入到 24.6 ml PBS中，使最终浓度为1:256。 2.2.2 四个单位血凝单位检测 检查4 HAU的血凝价是否准确，应将配制的1:256稀释液进行系列稀释，使最终稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7。然后，从每一稀释度中取0.025ml，加入PBS 0.025ml，再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml，混匀。将血凝板置室温20～40分钟或置2～8℃ 40～60分钟，如果配制的抗原液为4 HAU，则1:4稀释度将给出凝集终点；如果4 HAU高于4个单位，可能1:5或1:6为终点；如果较低，可能1:2或1:3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4 HAU。 2.2.3 第2～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。 2.2.4 第1～2孔加入0.025ml血清，第2孔血清与PBS充分混匀后吸0.025ml于第3孔，依次2倍系列稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。 2.2.5 第1～11孔均加入0.025ml的4HAU抗原，在室温（20～25℃）下静置至少20分钟或2～8℃ 至少60分钟。 2.2.6 每孔加入0.025ml 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20～40分钟或2～8℃ 40～60分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。 3 结果判定 以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI抗体效价。测定鸡血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1:4时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:8判为阴性，不低于1:16判为阳性。检测鸭和鹅血清时，当阳性对照血清的HI抗体效价与已知抗体效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清抗体效价不高于1:10时，试验方可成立；被检血清HI抗体效价不高于1:10判为阴性，高于1:10（不含1:10）判为阳性。 【注意事项】 （1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。 （2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。 （3）用pH值7.0～7.2的PBS（0.01mol/L）作为稀释液。 （4）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。 （5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。 （6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超过1个月。 （7）同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI抗体效价不同。 （8）鸭、鹅血清一般需进行非特异性凝集抑制素的处理，并分别以鸭、鹅阳性血清、阴性血清作为HI试验对照血清。处理参考如下方法，可根据本实验室实际情况选择使用。 ① 胰酶-加热-高碘酸盐法 A.取0.3ml血清，加0.15ml胰酶溶液（8 mg/ml：200mg的P-250胰酶溶解于25ml的0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，分装并在-15℃以下保存，保存期6个月），混匀后，在56℃水浴灭活30分钟后冷却至室温。 B.再加入0.9ml高碘酸钾（将230mg的KIO4用0.01mol/L, PH 7.0～7.2的PBS，定容至100ml，过滤除菌后避光室温保存，保存期1周），混合，室温孵育15分钟。 C.再加入0.9ml的丙三醇盐溶液（1ml的丙三醇加入到99ml的0.01mol/L, pH值 7.0～7.2的PBS中，混匀，过滤除菌，室温保存），混合，室温孵育15分钟。 D.最后加入0.75ml生理盐水，混匀，置4℃保存备用。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 ② 受体破坏酶（RDE）处理法 A.1体积血清（50μl），加4体积RDE（200μl），37℃水浴18小时（过夜）。 B.再加入5体积（250μl）的1.5%浓度的柠檬酸钠，混匀，置56℃水浴30分钟（以破坏残余的RDE活性）。 C.将1体积的50%的红细胞加入到10体积RDE处理的血清中（50μl红细胞+500μl血清），震荡混匀后4℃放置1小时，期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次。 D.1000g离心10分钟，小心吸取上层上清，用于检测。处理后的血清最终为10倍稀释的血清。 【规格】 （1）1ml/瓶 （2）2ml/瓶 【包装】 10瓶/盒、24盒/箱、60盒/箱。 【贮藏与有效期】 −15℃以下保存，有效期为24个月。 【批准文号】 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 （二）禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清内包装标签 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）血凝抑制试验抗原 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）抗体。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）阳性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型（H7-Re2株）HI试验阳性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型阴性血清（鸡） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型阴性血清（鸭） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 禽流感病毒H7亚型阴性血清（鹅） 兽用 1（2）ml/瓶 生产文号： 批 号： 生产日期： 【作用与用途】 用于禽流感病毒H7亚型HI试验阴性对照。 【用法与用量】 见使用说明书。 【贮藏与有效期】 −15℃以下，有效期为24个月。 【生产企业】 仅供兽医诊断使用 收藏（0）